Cenni sulle tecniche di Analisi chimica per gli estratti magistrali di cannabis
Gli estratti vegetali sono miscele complesse costituite da varie specie molecolari solubilizzate nel solvente di estrazione, la quantità relativa della singola sostanza in un estratto non è funzione della sola rappresentanza nella pianta bensì i fattori determinanti la frazione rispetto al 100% molecolare nel fitocomplesso sono principalmente funzione della solubilità nel solvente utilizzato e delle modalità operative in fase di estrattiva. Ciò significa che utilizzando un altro solvente e/o altre condizioni operative il fitocomplesso può cambiare anche in modo sostanziale nella sua composizione. In questo contesto risulta evidente l’enorme difficoltà nell’investigare l’intero profilo fitochimico di un derivato erbale. Per quanto detto oltre a tecniche note si usa una innovativa metodica; la NMR protonica, una tecnica analitica strumentale che permette di ottenere informazioni dettagliate sulla composizione del fitocomplesso. Una specie di fotografia dell’ intera struttura molecolare della miscela dall’osservazione del comportamento dei nuclei atomici in un campo magnetico.
In genere per i derivati erbali oltre allo spettro NMR si determinano alcuni marker chimici non sempre direttamente correlabili con l’attività fisiologica o farmacologica ma come indice qualitativo o quantomeno di range di accettabilità prefissati dalle farmacopee o derivati dalla letteratura scientifica accreditata. Chiaramente in caso di allestimento galenico normalmente il farmacista utilizza un estratto già standardizzato nel titolo ed in quantità note.
Nel caso degli estratti magistrali di cannabis medica, seppur titolati a livello di infiorescenza tal quale nei marker più conosciuti con l’estrazione estemporanea si rende necessaria una nuova titolazione al fine di assicurarne una certa qualità intesa come resa estrattiva e permettere a medico e paziente il corretto utilizzo in termini di dosi dell’estratto stesso.
Le righe che seguono vogliono essere un aiuto per i non addetti e/o professionisti non intrinsecamente coinvolti nelle logiche della chimica analitica ma che vogliono meglio orientarsi nei concetti e termini dell’ambito tecnico-analitico sugli estratti estemporanei di cannabis in particolare, confidando nella comprensione dei più esperti per le eccessive e pur necessarie semplificazioni.
Con decreto del 9-11-2015 le analisi si estratti estemporanei di cannabis diventano controlli di routine, il decreto in questione (all. tecnico) recita: Per assicurare la qualità del prodotto la titolazione del principio attivo deve essere effettuata per preparazione magistrale con metodologie sensibili e specifiche quali la cromatografia liquida o gassosa accoppiate alla spettrometria di massa. Naturalmente è a questo che le regioni nel legiferare in merito alla rimborsabilità da parte dei rispettivi sistemi sanitari hanno fatto riferimento. La metodica analitica coniuga l’irrinunciabile validità del metodo alla fattibilità in un contesto produttivo quotidiano come quello delle farmacie territoriali o ospedaliere.
Le tecniche di cromatografia ( scrittura colorata ) sono molto utilizzate in chimica-farmaceutica. In realtà si tratta di metodi separativi di miscele i cui componenti difficilmente potrebbero essere separati con altre metodiche. Nel 1906 il biologo russo Tswett riempiendo di gesso finemente suddiviso una colonna di vetro munita di valvola di scarico ha versato una miscela di pigmenti verdi da piante e ha fatto attraversare la colonna da etere di petrolio osservando una stratificazione orizzontale delle varie tonalità di verde. Successivamente si è capito che la stratificazione delle tonalità in una miscela di questo genere avviene sfruttando la diversa velocità di spostamento che ciascuna di queste sostanze presenta quando distribuita intimamente in un mezzo essa viene sottoposta all’azione di un solvente in moto. Dagli anni 40 in poi si è preso coscienza dei fenomeni chimico-fisici alla base delle separazioni. La fase in cui vengono dispersi le miscele viene detta fase fissa mentre il solvente fase mobile. Non possiamo addentrarci più di tanto nelle tecniche cromatografiche che necessitano di conoscenze chimiche di tipo specialistico basta solo sapere che le velocità di spostamento delle specie chimiche che compongono la miscela dipendono dalle interazioni tra le fasi dove alla base ci sono fenomeni come; adsorbimento, ripartizione, scambio ionico, esclusione, affinità da cui si sono sviluppate diverse tecniche cromatografiche tra cui la gas-cromatografia GC e cromatografia liquida ad alta pressione HPLC entrambe interessate dal decreto in questione.
Nella Gas-Cromatografia la fase mobile è un gas, la tecnica consente di separare miscele come residui di estrazione da materiale biologico. La fase fissa o stazionaria può essere un solido o un liquido e si trova in una colonna collocata in un forno termostatato. Se la fase fissa è solida si parla di gas-cromatografia gas-solido (GSC) e prevalgono i fenomeni di adsorbimento. Se la fase fissa è un liquido si tratta di gas-cromatografia gas-liquido (GLC) e i fenomeni prevalenti sono quelli di ripartizione.
La cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) Molto utilizzata in farmaceutica ha tempi di esecuzioni brevi con elevata selettività, sensibilità e limite di rivelabilità oltre ad un ampio spettro di applicabilità. In questo tipo di cromatografia la fase mobile viene pompata ad una pressione elevata in una colonna dove si trova il campione nella fase fissa. Le interazioni che avvengono possono essere di adsorbimento, ripartizione, scambio ionico ed esclusione.
I rivelatori: Una volta che la miscela è stata separata cromatograficamente vengono lette le tracce in uscita per determinare le quantità relative delle sostanze nella miscela di partenza. I rilevatori devono avere essenzialmente caratteristiche di sensibilità, selettività e un adeguato “range dinamico” che rappresenta l’intervallo fra le concentrazioni dei campioni per i quali il detector da risposte proporzionali alla quantità della molecola saggiata. Si tratta di analizzatori strumentali posti in uscita e che possono determinare in modo quali-quantitativo le frazioni separate.
In gascromatografia prevalentemente sono utilizzati quelli a ionizzazione di fiamma o a cattura di elettroni in HPLC in particolare si utilizzano i rilevatori in UV.
La spettrometria di massa si basa sulle osservazioni effettuate nei primi anni del 1900 da J.J. Thompson che gli valsero il premio nobel per la fisica nel 1906. Fondamentalmente il campione da analizzare viene prima ionizzato. All’interno di uno spettrometro di massa si hanno tre passaggi:
1) produzione e/o frammentazione di ioni.
2) separazione di ioni.
3) rivelazione di ioni.
Il flusso di ioni prodotto nella prima fase entra nell’analizzatore, fondamentalmente un tubo curvo immerso in un campo magnetico di intensità F, il raggio R dell’orbita percorsa dallo ione sarà dato da:
R2 = (m/c) x (2V/F2)
dove m è la massa dello ione, c la sua carica e V la velocità iniziale.
Si deduce che il fascio di particelle ionizzate può essere suddiviso nelle specifiche traiettorie delle singole masse agendo sull’intensità del campo magnetico o sulla velocità quindi sul loro potenziale di accelerazione. L’insieme di masse ionizzate viene focalizzato da un collettore-rivelatore dove gli ioni cedono le loro cariche e la corrente ionica che ne deriva amplificata e registrata rappresenta l’insieme delle risposte costituendo lo spettro di massa. Con questa tecnica è possibile determinare la massa esatta, formula bruta, struttura e abbondanza chimica.
schema analizzatore MS
Diverse sperimentazioni confermano la validità dei metodi di separazione cromatografica CG e HPLC associata alla spettrometria di massa e negli ultimi anni si sono sviluppati molto le interfacce HPLC-MS. Questo tipo di strumentazione si trova in centri di analisi specializzati generalmente universitari. Naturalmente questo ha un costo economico e può prolungare i tempi di consegna del preparato di qualche giorno.
Letture consigliate:
G. Volpago G. Bartorelli. Analisi tecniche:metodi strumentali e chimici. Ed. Bocchi.
T.W. Grahm Solomons. Chimica Organica ed. Zanichelli
Societa Cooperativa farmaceutica Medicamenta vol. II Ed. VII
Farmacopea Ufficiale Italiana XII.
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